PRACTICA 1

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE

CD. ALTAMIRANO

PRÁCTICA 1:

“Reconocimiento de laboratorio

de cultivos vegetales”

   M.C. Francisco Javier Puche Acosta

PRESENTAN:

Rosalina García Suárez 08930339

Yactivany Atanasio Serrano 08930340

Esbeide de Paz Leonides 08930371

Víctor Manuel Vargas torres 08930311

Bellanira Pineda Pineda 08930130

 LIC. BIOLOGÍA

 CD. ALTAMIRANO, GRO.              FEBRERO 2012

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

BIOTECNOLOGÍA APLICADA

PRÁCTICA No.1.

RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS

RESUMEN

La presente práctica se realizó, en el laboratorio de microbiología, localizado en el Instituto Tecnológico de Cd Altamirano. Se reconocieron las distintas áreas que constituyen al laboratorio de cultivos vegetales, así como los principales materiales y equipos que tienen mayor utilidad en el proceso de producción de los mismos. Obteniendo como resultado, la identificación de las áreas necesarias para la producción in vitro de vegetales en laboratorio. Con  lo antes mencionado nuestro  objetivo principal es reconocer las diferentes áreas y equipos básicos, normas de comportamiento y reglas de bioseguridad dentro del laboratorio. Concluyendo que el laboratorio cuenta con la mayoría de materiales necesarios para realizar y producir cultivos vegetales.

Palabras claves: Laboratorio, Cultivos Vegetales, áreas de laboratorio, equipo y material.

 

ÍNDICE

                                                                                                                                         PÁG.

1. Antecedentes

2. Definición del problema

3. Objetivos

3.1. Objetivo General

3.1. Objetivo específico

4. Justificación

5. Fundamento teórico

5.1 Laboratorio de cultivos vegetales

5.2 Funciones del laboratorio de cultivos vegetales

5.3 Áreas de un laboratorio de cultivos vegetales

5.4 equipo y material de laboratorio

5.4.1 Cristalería

5.4.2 Instrumentos y aparatos

5.5 ventajas y desventajas de un laboratorio

5.6 Normas de laboratorio de tejidos vegetales

5.6.1 Utilización de reactivos

6. Materiales y Métodos

6.1.  Recorrido en el laboratorio de microbiología

6.2. Identificación y descripción de cada área de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales

7. Resultados

8. Conclusiones

9. Recomendaciones

10. Fuentes consultadas

 

I. ANTECEDENTES

Para la construcción del laboratorio de cultivo de tejidos se pueden utilizar estructuras (muros, paredes, pisos, puertas, servicios, etc.) ya existentes. Sin embargo, puede ser necesario levantar dichas estructuras, y en este caso se recomienda hacer uno grande, dentro de la cual se puedan instalar divisiones o paredes con material liviano prefabricado como planchas de triplex o de cartón piedra; así se facilita el diseño  de las áreas, ajustando el espacio en los requerimientos inmediatos del laboratorio. Esta estrategia de construcción también facilita futuros cambios en el tamaño del espacio, (Roca &Mroginski).

El laboratorio de cultivo de tejidos debe disponer de un área destinada al establecimiento, crecimiento y multiplicación de las plantas producidas; esta área es especialmente necesaria en los laboratorios de investigación y desarrollo y en los de producción comercial. Aquellos laboratorios que se dedican a la producción y distribución de materiales de sanidad certificada por ejemplo, deben incluir además facilidades para la cuarentena y para la evaluación fitosanitaria, (Roca &Mroginski).

La técnica in vitro consiste en tomar una sección de tejido vegetal (explante) y desinfectarlo superficialmente de todo microorganismo, mediante la inmersión total en una solución de hipoclorito de calcio o sodio y colocarlas en un recipiente de vidrio que contiene un medio nutritivo gelificado estéril. Este medio de cultivo contiene: vitaminas, aminoácidos y azúcares, complementando con fito-hormonas necesarias para dirigir la formación de las plántulas. La siembra se realiza dentro de una cámara de flujo laminar que asegura un ambiente aséptico. El tejido sembrado es trasladado a un cuarto de incubación donde proliferan las células. En el tratamiento de la célula, tejido u órgano, que se desarrollan mediante esta técnica, se controlan aspectos como temperatura y fotoperiodo, con el objetivo de crear las condiciones para un rápido desarrollo (FIAGRO, 2004).

II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

El Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano no cuenta con un laboratorio exclusivo para la propagación de cultivo in vitro de plantas, es por ello que se pretende ajustar el laboratorio de microbiología y adecuar las condiciones ambientales, de tal forma que el alumno pueda realizar medios de cultivo de tejidos vegetales en él. Debido a que el alumno no tiene el conocimiento práctico de realizar cultivos vegetales en un laboratorio, es necesario que se familiarice y conozca la función, equipo y material de cada una de las áreas básicas que lo constituyen, para que pueda operar en este de forma acertada. Así mismo deberá aprender las medidas de seguridad y prácticas de mantenimiento del laboratorio para que pueda obtener buenos resultados.

III. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

ü  Conocer las áreas del laboratorio, material y equipo mínimo indispensable en la preparación de los medios de cultivo.

3.2 Objetivos específicos

ü  Identificar las diferentes áreas, equipo y material básico que constituye un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.

ü  Conocer las principales normas de comportamiento y seguridad dentro del laboratorio.

IV. JUSTIFICACIÓN

El reconocimiento de las áreas básicas que integran un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, es fundamental para realizar y manejar los mismos, así como también conocer su función, equipo y material proporciona al alumno las herramientas necesarias para operar en él. El conocimiento y aplicación de las  normas de seguridad del laboratorio son un instructivo que provee en cierta forma un buen manejo de él, así como la seguridad del personal. Es por ello de gran importancia que el alumno maneje y conozca el funcionamiento de un laboratorio de cultivo de tejidos para producir plantas y conocer cómo se lleva acabo cada proceso. Así mismo el montaje y adecuación del laboratorio de microbiología permitirá que en él se sigan realizando posteriores prácticas e investigaciones, las cuales contribuyan al conocimiento y aprendizaje de alumnos de las posteriores generaciones.

V. FUNDAMENTO TEÓRICO

5.1 Laboratorio de cultivos vegetales

Es un área especializada en el cultivo de tejidos vegetales in vitro (en vidrio).Esta técnica consiste en cultivar pequeñas piezas de plantas en frascos de vidrio con un medio de cultivo (terreno) nutritivo estéril. Para el desarrollo de la investigación, en el campo del cultivo de tejidos, se requieren de materiales que permitan la preparación de fórmulas nutrimentales con el objetivo de cultivar tejidos, órganos y células vegetales in vitro. (María E.M. 1987)

5.2 Funciones del laboratorio de cultivos vegetales

 El laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales se dedica a la micropropagación comercial de plantas; así como también a la investigación. El trabajo con especies forestales constituye un avance muy significativo en nuestro país, si consideramos que su proceso de propagación tradicional es complicado por el tiempo que demora su reproducción, así como el ataque de plagas en fase de vivero, y mediante la técnica de cultivo de tejidos, se pueden seleccionar plantaciones con genotipos sanos.(Sussex, 1963; Ingram y Robertson). Aplicaciones prácticas del cultivo in vitro en el laboratorio:

Propagación vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos técnicas:

ü  Micropropagación de estaquillas

ü  Organogénesis de callos

Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas:

ü  Cultivo de meristemos

ü  Microinjerto in vitro

·         Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones normales.

·         Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in vitro.

·         Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión.

·         Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles dan abortos.

·         Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético, etc.

·         Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados.

Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Ventajas:

ü  Obtención rápida de homocigotos.

ü  Producción de híbridos (frutos puros).

5.3 Áreas de un laboratorio de cultivos vegetales

Un laboratorio de tejidos se puede dividir esquemáticamente en áreas separadas de acuerdo a las diferentes funciones que desarrollan en él. (Wang, 1977 y Solórzano, 1983) A continuación se presentarán los diferentes materiales que se encuentran en un laboratorio que desarrolla actividades en el campo mencionado:

Área de preparación: Se utiliza principalmente para preparar medios de cultivo, pero debe proveer un espacio para los materiales de vidrio, plástico y los reactivos  químicos.

Área de lavado y esterilización: constituida por dos áreas de lavado conectadas entre sí, las cuales pueden estar dentro del área de preparación, su principal función es la esterilización de todo material ajeno al laboratorio o bien desinfectar las áreas a utilizar.

El área de lavado debe tener una entrada de corriente de agua fría y caliente, así como un lavadero grande, el agua debe tener un alto grado de pureza.

El área de esterilización debe tener un espacio para el autoclave vertical u horizontal la cual puede sr pequeña (olla de presión) o grande (de carga frontal y de  enfriamiento lento o rápido).

Área de trasferencia: aquí se realiza el trabajo de excision, inoculación y trasferencia de los explantes a los medios de cultivo.

Área de incubación: Esta área debe proporcionar un buen control de la temperatura (20-28 grados) de iluminación variable según las necesidades y de la humedad relativa (70%-80%), aquí se instalan estanterías metálicas o de madera para colocar los cultivos.

Área de observación: generalmente se encuentran los microscopios, esto con el fin de realizar observaciones periódicas de los cultivos.

Área de crecimiento: Esta área consiste en acondicionar o aclimatar un área donde y luego trasplantar en bandejas, macetas que salen del área de incubación, generalmente se ubican en invernaderos los cuales están acondicionados de acuerdo al tipo de plantas obtenidas.

5.4 EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO

El material  y equipo de laboratorio en el cultivo de tejidos,  requiere de materiales que permitan la preparación de fórmulas nutrimentales con el objetivo de cultivar tejidos, órganos y células vegetales in vitro (Elliott 1972; Jones). A continuación se presentarán los diferentes materiales que se encuentran en un laboratorio de biotecnología:

5.4.1 Cristalería

La cristalería de uso más común para el cultivo de tejidos se selecciona de la que se utiliza en experimentos químicos o de microbiología; sin embargo, poco de este material está diseñado especialmente por investigadores.

Se utiliza bastante material de vidrio en la preparación de medio de cultivo y en la siembra de tejidos vegetales. Los cuales son:

ü  Tubos de ensayo

ü  Matraces Erlenmeyer

ü  Cajas de petri

ü  Botellas para cultivo

ü  Botellas para reactivos y soluciones madre

ü  Pipetas, goteros, probetas y matraces

ü  Vasijas de vidrio para la distribución de medio de cultivo

ü  Jeringas dispensoras

5.4.2 Instrumentos y aparatos

Para el cultivo de tejidos hay pocos aparatos e instrumentos diseñados especialmente para este propósito. Sin embargo, se pueden escoger varios instrumentos médicos, así como también muchos aparatos de microbiología.

ü  Filtros y esterilizadores

ü  Cámara de flujo laminar

ü  Hornos para secado 

ü  Autoclaves

ü  Refrigerador y congelador

ü  Balanzas

ü  Balanzas analíticas

ü  Medidores de pH

ü  Destilador

ü  Agitador magnético

5.5 VENTAJAS y DESVENTAJAS DE UN LABORATORIO

Ventajas

ü  Se pueden tener muchísimas plantas en espacios reducidos, con condiciones controladas y a bajo costo

ü  Garantiza sanidad completa de las plantas hijas.

ü  Cuando la planta sale al campo es capaz de crecer y vivir como una planta normal.

Desventajas

ü  Técnica sensible en laboratorio.

ü  Cantidad y costo.

ü  Inestabilidad. Muchas de las líneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la dotación cromosómica aneuploide

5.6 Normas de laboratorio de tejidos vegetales

Ø  Use bata de laboratorio para cada práctica y no utilice calzado destapado

Ø  Use guantes, tapaboca, lentes de protección, y máscara con filtros

Ø  No pipetee con la boca, use un pipeteador

Ø  No se lleve los dedos a la boca, ojos o nariz, ni respire directamente sobre ningún reactivo pues sus vapores pueden ser tóxicos

Ø  No ingiera alimentos o bebidas en el laboratorio

Ø  No use durante las prácticas anillos, cadenas, prendedores, pulseras o collares

Ø  No deposite alimentos en las neveras, ni consuma el hielo que allí se produce

Ø  No se admiten en el laboratorio personas que no estén matriculadas en el respectivo curso, por favor no reciba visitas

Ø  No ubique bolsos, tulas, maletines o paquetes, en los lugares de trabajo

5.6.1 UTILIZACIÓN DE REACTIVOS

Ø  Todo reactivo preparado debe rotularse con el nombre del reactivo, la persona que lo preparó y la fecha de preparación

Ø  No arroje por los sumideros ácidos, bases o algún otro reactivo, por favor deposítelos en los recipientes de desecho

Ø  Evite derrames de sustancias en las mesas de trabajo, así se previene que algún compañero se queme la piel o se deteriore la ropa.

Ø No arroje al piso ningún reactivo

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

La presente práctica se desarrolló en el laboratorio de microbiología que se localiza dentro del instituto tecnológico de cd Altamirano.

La Cd. de Altamirano municipio de Pungarabato, se localiza al noroeste del estado de Guerrero, en la región de Tierra Caliente y en las coordenadas geográficas 18°25’ de latitud norte y los 100°31’ y 100°43’ de longitud oeste. Este municipio es muy caluroso al experimentar un clima de tipo Cálido Subhúmedo con lluvias en verano y una temperatura promedio que varía de los 26 a 28 °C. Presenta una altitud de 241 msnm y una precipitación pluvial promedio de 1000 a 1,100 mm al año.

6.1.  Recorrido en el laboratorio de microbiología

Una vez que se ingresó al laboratorio de microbiología el docente dio instrucciones para iniciar el recorrido sobre este, con la finalidad de identificar en él, las áreas que constituyen un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales. Para ello los alumnos se turnaron para pasar debidamente a reconocer y observar estas áreas. El recorrido se  hizo de forma ordenada hasta analizar por completo el laboratorio. Figura 1.

Figura 1. Laboratorio de microbiología del Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano.

Durante el recorrido se fueron reconociendo las áreas y observando su estructuración, así como también identificando el material y equipo de cada una de estas; se hizo uso de una cámara fotográfica para captar cada una de las áreas, así como también de un cuaderno de notas y lapicero, para plasmar datos sobre las mismas.

6.2. Identificación y descripción de cada área de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales

La primer área identificada fue el área de preparación de medios de cultivo, la cual está dotada con tres balanzas analíticas, potenciómetro, cajones de madera que contienen materiales de vidrio y plástico, así como pinzas, probetas y picetas. Esta área carece de un refrigerador ya que este está situado a un lado del área de lavado. Figura 2.

Figura 2. Área de preparación de medios de cultivo: a) balanza analítica; b) mesas de trabajo.

El área de lavado y esterilización, en el laboratorio de microbiología se encuentran separadas. El área de lavado cuenta con tres lavabos y con su respectiva llave de agua fría, cuenta con escurridores y charolas de plástico, un cesto de basura, cubetas, franelas, detergente y fibras. Por su parte el área de esterilización está equipada con una parrilla de gas y una autoclave. Figura 3.

  Figura 3. Área de lavado y esterilización: a) área de lavado; b) autoclave y parrilla de gas.

El área de siembra está situada cerca de las mesas de trabajo en el laboratorio y cuenta solo con la campana de flujo laminar, ya que los microscopios y estereoscopios se encuentran almacenados en anaqueles en el área de reactivos bajo llave. Figura 4.

 

Figura 4. Campana de flujo laminar. En cuanto al área de incubación en el laboratorio se buscó el lugar idóneo y con las características y parámetros adecuados para montarla, debido que se carece de esta, pero se tiene una caja de metal y cristal que se pretende adecuar para usarla como estante de incubación de cultivos. Figura 5.

 

Figura 5. Vitrina para área de incubación.

El laboratorio cuenta con un Área de reactivos aislada, en la cual se encuentran almacenados diversos reactivos en anaqueles metálicos, así como microscopios y estereoscopios, también contiene el apartado donde es almacenada la cristalería, como: matraz, vasos depresipitados, pipetas, frascos y cajas de Petri. Figura 6.

Figura 6. Área de reactivos: a) estantes con reactivos; b) cajón de cristalería.

Este laboratorio cuenta también con un área de oficina, desde la cual se controla el paso y uso del laboratorio, esta área cuenta con un estante metálico para libros, dos equipos computacionales, sillas y dos escritorios.

 

VII. RESULTADOS

El alumno logro identificar fácilmente cada una de las áreas que constituyen un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, gracias a los conocimientos ya adquiridos, así mismo le fue fácil reconocer el material y equipo correspondiente a cada una de las áreas identificadas. En el siguiente cuadro se muestran las áreas identificadas, su función, material y equipo que la conforman y las técnicas de manejo y mantenimiento de cada una de estas. Cuadro 1.

Cuadro1. Áreas del laboratorio de un cultivo de tejidos identificadas en el laboratorio de microbiología del Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano.

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Área de Laboratorio	Función	Equipo y Material	Manejo y mantenimiento
Área de preparación de medios	Es el espacio físico donde son pesadas las sustancias y reactivos que forman parte del medio de cultivo, en esa misma área se mezclan, disuelven y aforan.	Equipo: balanza analítica Material: matraz, vasos depresipitados, probeta, picetas, aluminio, algodón y cinta adhesiva	El alumno debe usar guantes, cubrebocas y bata de laboratorio, la balanza debe estar debidamente equilibrada y limpia antes y después de pesar los reactivos y sustancias.
Área de lavado	En esta área se lavan y los materiales utilizados y a utilizar.	Equipo: lavaderos y extintor. Material: agua, escurridores de plástico, cubetas, franelas, detergente, fibras y charolas.	El alumno debe depositar la basura o residuos en el cesto de basura y poner a secar el material utilizado.
Área de esterilización	Es el espacio en el cual se libera al medio y material a utilizar de microorganismos.	Equipo: autoclave y parrilla.	El alumno debe utilizar bata, guantes y cubrebocas; una vez utilizada la olla de presión le debe ser retirada el agua.
Área de siembra	Es el área donde se cortan, seleccionan y colocan los explantes en el medio nutritivo.	Equipo: cámara de flujo laminar	El alumno debe esterilizase debidamente las manos, usar bata y cubrebocas. La campana se debe esterilizar y dejar limpia siempre.
Área de incubación	Se carece de área de incubación
Área de reactivos	Es el espacio en el cual se almacenan los reactivos que se emplean para crear el medio nutritivo.	Equipo: estantes metálicos, estereoscopios y microscopios. Material: reactivos.	El área debe permanecer cerrada y en condiciones ambientales estables y estrictas.
Área de oficina	Es donde se lleva el control del laboratorio.	Equipo: computadoras. Material: libros, revistas, y manuales.

  VIII. CONCLUSIÓN

Los objetivos planteados al inicio de la presente práctica se lograron en su totalidad, ya que se consiguió identificar y conocer las áreas, el material y equipo básico que constituye un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales. También se consiguió conocer las principales normas de comportamiento y seguridad dentro del laboratorio.

Cabe mencionar, que como el laboratorio de microbiología carece del área de incubación se pretende montarla, con las condiciones necesarias e idóneas para su correcto funcionamiento. De tal forma que se eligió el área y se hizo una posible propuesta de equipo y material para diseñarla.

IX. RECOMENDACIONES

ü  Es recomendable que para realizar un cultivo in vitro de vegetales, el laboratorio este equipado en cada una de sus áreas y cuente con las condiciones ambientales adecuadas.

ü  Es de gran importancia que la persona a manejar el laboratorio conozca el correcto funcionamiento del equipo y material de este. Así como también las normas de seguridad para evitar accidentes.

ü  Se recomienda también que el trabajador conozca las medidas de seguridad para operar en cada área y utilice bata, guantes y cubrebocas para asegurar más higiene en la producción.

X. FUENTES CONSULTADAS

& Barrera Badillo G. y Oliver Salvador (2004). III Congreso Internacional y XIV

& Biotecnología Vegetal  (cultivo de tejidos, manual) González, Cruz, Camarillo, Silos. 2000. SEP. 133p.

& Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica. Veracruz, Ver. del 31 de marzo al 2de abril.

& Henry R.J. Smith E.C. 1946. Use of sulfuric acid-dichromate mixture in cleaning glassware. Science 104: 426-427.

& Kieran, P.M., Mac Loughlin P.F., Malone D.M. (1997). Plant cell suspensioncultures: some engineering considerations. Journal of Biotechnology. 59, 39-52.

& Manual de laboratorio de biotecnologia (Documento pdf. Pag.1/82)

& Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.

& Murashige, T. And Skoog, 1962. A revised medium of rapid growth and bioassays

& redgfubcs.com/Biotech%20Lab/Biotech%20Lab.html

& Roca. W., y Moginski. L. 1991. Cultivo de Tejidos en la Agricultura (Fundamentos y Aplicaciones). Cuarta Edicion. Editorial CIAT. Colombia.

& (Sussex, 1963; Ingram y Robertson, 1965; Accatino, 1966; Gregorini y Lorenzi, 1964; Mellor y Stace – Smith, 1977; Wang, 1977 y Solórzano, 1983), chile (Juo, Wahg y Chien, 1973), fresa (Belkengren y Muller, 1962), manzano (Elliott 1972; Jones, 1976; Aboot, 1976; Jones y Hopgood, 1979), vid (Barlass y Skene, 1978), e articulos.infojardin.com/Frutales/cultivo-in-vitro-reproduccion.htm.

& with tobacco tissue. Physiol. Plantarum. 15:473-497.

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE

CD. ALTAMIRANO

PRÁCTICA 2:

“PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE”

   M.C. Francisco Javier Puche Acosta

PRESENTAN:

Rosalina García Suárez 08930339

Yactivany Atanasio Serrano 08930340

Esbeide de Paz Leonides 08930371

Víctor Manuel Vargas torres 08930311

Bellanira Pineda Pineda 08930130

 LIC. BIOLOGÍA

 CD. ALTAMIRANO, GRO.              FEBRERO 2012

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

BIOTECNOLOGÍA APLICADA

PRÁCTICA No.2.

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE

RESUMEN

La presente práctica se realizó, en el laboratorio de microbiología, localizado en el Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano. Se preparó una solución madre de nitratos, de la cual se pesaron 33g de nitrato de amonio y 26g de nitrato de potasio en la balanza analítica, para aforarse a 200ml con agua destilada. El resultado obtenidofue una solución madre con un volumen de 200ml, la cual se almaceno en una botella ámbar, para ser utilizada posteriormente en el medio nutritivo. El Cálculo y pesado de sales, para la preparación de la solución stock de nitratos fue el objetivo perseguido en el presente trabajo, con esto se llegó a la conclusión que, para preparar una solución madre se tiene que medir con exactitud, la cantidad de reactivo requerida en cada preparación, esto con la finalidad de que no existan variaciones que perjudiquen el desarrollo del tejido vegetal a propagar.

Palabras clave:solución madre, nitrato de amonio, nitrato de potasio, medio de cultivo.

ABSTRACT

This practice was held in the microbiology laboratory, located in the Technological Institute of AltamiranoCity. Was prepared a solution of nitrates, which weighed 33g of ammonium nitrate and potassium nitrate 26g on ​​the analytical balance, to gauging to 200ml with distilled water. The result obtained was a solution with a volume of 200ml, which were stored in an amber bottle for later use in the nutrient medium. The Calculation and heavy salts for the preparation of the nitrate stock solution was the objective pursued in this work, it is concluded that, to prepare a stock solution must be measured accurately, the amount of reagent required in each preparation, this in order that there are no variations that may impair the development of plant tissue to propagate.

Keywords: stock solution, ammonium nitrate, potassium nitrate, the culture medium.

ÍNDICE

PÁGINA.

1.Antecedentes………………………………………………………………………......5

2.Definicióndel problema…………………………………................................................6

3. Objetivos………………………………………………………......................................7

3.1.Objetivo general…………………………………………..............................................7

3.1.Objetivoespecífico……………………………………………………………………..7

4. Justificación……………………………………………………………………….........8

5. Fundamento teórico…………………………………………………………………...9

5.1 Solución Madre o Stock………………………………………………………………..9

5.2 Macronutrientes………………………………………………………………………….9

5.3 Micronutrientes………………………………………………………………………….10

5.4 Preparación de medios de cultivo…………………………………………………….10

5.4.1 Preparación de una solución stock de macronutrientes MS x10 (solución 1)…...10

5.4.2 Preparación de una solución stock de micronutrientes MS x 100 (solución 2).....11

6. Materiales y Métodos…………………………………………………………………..12

6.1. Forma de trabajo y cálculos para realizar la solución stock………………………...12

6.2. Pesado de nitrato de amonio y nitrato de potasio…………………………………...12

6.3. Aforar y preparar la solución stock de los nitratos…………………………………...13

7. Resultados……………………………………………………………………….….......14

8. Conclusiones……………………………………………………………………………18

9. Recomendaciones….…………………………………………………………………..19

10. Fuentes consultadas………………………………………………………..………..20

I.ANTECEDENTES

Los medios generalmente son preparados a partir de soluciones Stock previamente mezcladas. Las alícuotas de estas soluciones son medidas y agregadas aun volumen dado de agua. En algunos casos los componentes indicados son pesados y agregados directamente al volumen de agua, quedando así preparado el medio. Los procedimientos incorrectos pueden causar precipitaciones, especialmente nitratos y fosfatos. Las soluciones Stock pueden prepararse y almacenarse en frio por largo tiempo, por lo cual se recomienda el uso de recipientes con tapa de vidrio. Todas estas soluciones deben prepararse con agua destilada, (Stein R. Janet, 1994).

Cuando una solución es de uso corriente en un laboratorio, se suele preparar una solución madre (solución Stock) de la misma y, a partir de esta, realizar la dilución que se necesite (llamada solución de trabajo) en el momento de usarla. Esto puede disminuir el volumen de almacenamiento de las soluciones y, además, muchas veces las soluciones concentradas son más estables que las diluidas. Un límite importante a tener en cuenta en la preparación de soluciones concentradas es la solubilidad de cada soluto (que tendrá una solubilidad determinada en una temperatura dada).

Se dice que una solución Stock es Nx (N por) cuando está concentrada N veces respecto de la de uso corriente. La solución de trabajo seria 1x. Esta forma de nomenclatura es particularmente útil para soluciones de varios solutos e indica que todos estos solutos estarán N veces más concentrados que lo que se esperaría en la solución de trabajo, (Guía de Trabajos Prácticos – Introducción a la Biología Molecular y Celular, 2011).

En un cultivo in vitro de tejidos vegetales, se denomina solución madre o Stock a cualquier solución de composición elevada y concentración definida, en la que el soluto puede ser uno o más compuestos químicos de los que conforman un determinado medio de cultivo y que mediante un proceso de dilución permita la preparación de 1 litro de medio de cultivo, (Pierik, 1990).

II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

Para cultivar tejidos vegetales es necesario proveer un medio nutritivo idóneo para que la planta se desarrolle, es por ello ineludible preparar soluciones madre, estándar o stock, ya que estas constituyen y juegan un papel de gran importancia en él. Para prepararlasprimero hay que reconocer el reactivo del cual será preparada la solución y asegurar que es el correcto, así mismo se necesita realizar cálculos precisos y exactos. Al pesar los reactivos se requiere de gran exactitud para asegurar buenos resultados, las soluciones a preparar deberán estar definidas adecuadamente y aforadas de acuerdo a las indicaciones que el docente establezca para un volumen determinado.

III. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Calculo y pesado de sales, para la preparación de la solución stock de nitratos.

3.2. OBJETIVO ESPECíFICO

 Forma de trabajo y cálculos para realizar la solución stock

 Pesado de nitrato de amonio y nitrato de potasio

 Aforar y preparar la solución stock de los nitratos

IV. JUSTIFICACIÓN

Realizar soluciones stock o bien soluciones madre, es una alternativa para preparar medios de cultivo en concentraciones definidas de nutrientes, de tal forma que el medio sea apto para una determinada especie vegetal y para su optimo crecimiento y desarrollo como cultivo in vitro. Una vez que el alumno se enfrente a la preparación de soluciones madre de un determinado reactivo, aprenderá a identificarlo, así como también a realizar cálculos para su pesado y disolución, lo cual fortalecerá su conocimiento y  experiencia para preparar soluciones stock en posteriores practicas o situaciones.

V. FUNDAMENTO TEÓRICO

5.1.Solución Madre o Stock

Una soluciónes una mezcla homogénea cuyas partículas son menores a 10 angstrom. Estas soluciones están conformadas por soluto y por solvente. El soluto es el que está en menor proporción y por el contrario el solvente esta en mayor proporción. Para diluir una solución es preciso agregar más % de disolvente a dicha solución y éste procedimiento nos da por resultado la dilución de la solución, y por lo tanto el volumen y concentración cambian, aunque el soluto no. Una solución madre o stock es una concentración de algún macro o micro nutriente necesario para el desarrollo adecuado  de explantes vegetales.

5.2. Macronutrientes

Son los que se requieren en cantidades de milimoles y son los elementos requeridos en mayor cantidad, (carbono C), oxígeno (O) e hidrógeno (N), aminoácidos, Vitaminas, proteínas y ácidos nucleicos. Comúnmente se adicionan como nitrato o amonio y menos usual como nitrito. El nitrito se añade en concentraciones de 25-40 milimoles y el amonio de 2 a 20 milimoles (Gamborg y Jerry, 1981) fósforo (P) empleado casi universalmente en forma de fosfatos; sin embargo, la alta concentración de fosfato en solución puede detener el crecimiento, azufre (S) como sulfato y con la posibilidad que se agregue en forma de sulfito o como sulfuro, pero con menos efectividad (Nitsch y Nitsch, 1969). Como fuente de azufre, además de los sulfatos, sulfitos, se encuentran la cisteína, metionina o glutation. La deficiencia de azufre da por resultado una etiolación; magnesio (Mg) es componente fundamental de la molécula de clorofila; el calcio (Ca) es parte importante integral de la membrana celular, además confiere protección a la membrana contra los efectos deletéreos de los metales pesados, salinidad y pH muy bajos; usualmente se adiciona como cloruro de calcio (CaCl2 2H2O)m nitrato de calcio (Ca (NO3)2) y menos comúnmente como fosfato tricálcico (Ca 3  PO4); fósforo y el potasio como el catión mayor y se adiciona en la forma de KNO3, KI, KCI Y K2 PO4. En términos general fósforo, calcio, magnesio y azufre son requeridos en concentraciones de 1 a 3 milimoles para un buen crecimiento. Sin embargo, existe un antagonismo entre el Ca² y el Mg². Cuando la concentración de Mg²+ es alta, se requiere también alta Ca²+. La concentración comparativa es a menudo más importante que la concentración absoluta de iones.

5.3. Micronutrientes

Los micronutrientes o elementos menores se añaden en concentración micromolar. Los elementos menores son seis, a saber: Fierro (Fe), zinc (Zn), manganeso (Mn), cobre (Cu), cobalto (Co), boro (B) y molibdeno (Mo) que forman parte de la estructura de algunas proteínas vegetales, o vitaminas de interés bioquímico-fisiológico. De los 6 elementos, el Zn, Mn, Fe, Cu y Mo intervienen en la síntesis de la clorofila y en la estructura del cloroplasto (Sundqvist et al, 1980). El manganeso es considerado como uno de los más esenciales, junto con el boro y el fierro; además tiene importancia de la fotosíntesis en donde interviene en la conservación de la ultraestructura de los cloroplastos. De acuerdo a Galston y Hillman (1961), el Mn es un cofactor de las enzimas peroxidasa que permiten la oxidación del ácido indolacético en las células vegetales. Doershug y Miller (1967) mencionan que la omisión reduce el número de brotes en cotiledones de lechuga. Asimismo su adición en alta concentración puede compensar la carencia del Mo en raíz de jitomate (Hannay y Street, 1954). En ocasiones el manganeso puede remplazar al magnesio, en algunos sistemas enzimáticos (Hewitt, 1948).

5.4.Preparación de medios de cultivo

5.4.1.Preparación de una solución stock de macronutrientes MS x10 (solución 1)

Para obtener un litro de dicha solución llénese un Erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añádase cada uno de sus componentes (Tabla 1) disolviéndolo totalmente antes de añadir el siguiente:

Substancia	Peso (en gramos)
NH4NO3	16,5
KNO3	19,0
CaCl2·2H2O	4,4
MgSO4·7H2O	3,7
KH2PO4	1,7

Para finalizar, bastará con verter el contenido en una probeta de 1 l, enrasar con agua destilada, trasladar la solución a su recipiente definitivo y agitarlo.Esta solución debe guardarse a 4 ºC.

5.4.2. Preparación de una solución stock de micronutrientes MS x 100 (solución 2)

Para obtener un litro de dicha solución llenar un Erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añadir cada uno de sus componentes (Tabla 2) disolviéndolo totalmente antes de añadir el siguiente.Para terminar, proceder del mismo modo que con la solución stock de macronutrientes. Esta solución también debe almacenarse a 4 ºC.

Substancia	Peso (en mg)
MnSO4·4H2O	2.230,0
ZnSO4·7H2O	860,0
H3BO3	620,0
KI	83,0
Na2MoO4·2H2O	25,0
CuSO4·5H2O	2,5
CoCl2·6H2O	2,5

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

La presente práctica se desarrolló en el laboratorio de microbiología que se localiza dentro del instituto tecnológico de cd Altamirano.

La Cd. de Altamirano municipio de Pungarabato, se localiza al noroeste del estado de Guerrero, en la región de Tierra Caliente y en las coordenadas geográficas 18°25’ de latitud norte y los 100°31’ y 100°43’ de longitud oeste. Este municipio es muy caluroso al experimentar un clima de tipo Cálido Subhúmedo con lluvias en verano y una temperatura promedio que varía de los 26 a 28 °C. Presenta una altitud de 241 msnm y una precipitación pluvial promedio de 1000 a 1,100 mm al año.

6.1. Forma de trabajo y cálculos para realizar la solución stock

Para llevar a cabo la practica el día 20 de febrero del presente año, el facilitador organizo a los alumnos por equipos de cinco integrantes cada uno, así mismo prosiguió a repartir los grupos de sales y compuestos orgánicos a cada equipo con la finalidad de que todos trabajaran. A este equipo le fue asignado el grupo de los nitratos, el cual comprende dos sales, que son: nitrato de amonio y nitrato de potasio. Posteriormente se realizaron los cálculos para realizar la solución stock con estas.

Los cálculos que se hicieron fueron para ambas sales (nitrato de amonio y nitrato de potasio). Se realizó a una concentración de 100x y a un volumen de 200ml. Tabla 1.

6.2. Pesado de nitrato de amonio y nitrato de potasio

Para iniciar la preparación del medio de cultivo primero fueron identificadas las sales nitrato de potasio y nitrato de amonio en el área de reactivos del laboratorio de microbiología, una vez localizados ambos reactivos se  calibro la balanza analítica (ver la figura 1) para realizar un pesado preciso de estos, así mismo otro compañero se encargó de elaborar dos pequeñas charolas de papel aluminio, sobre las cuales fueron colocadas las dos sales en la balanza.

El alumno encargado de realizar el pesado de los nitratos lo hizo cuidadosamente cuidando ser lo más exacto posible, así mismo empleo los cálculos realizados anteriormente. La primer sal en pesar fue el nitrato de amonio, de la cual se pesaron 33g., posteriormente fue puesta en ceros nuevamente la balanza, se introdujo la segunda charola de aluminio bacía y se pesaron 26g. de nitrato de potasio. Figura 1.

6.3. Aforar y preparar la solución stock de los nitratos

Una vez pesadas las dos sales del grupo de los nitratos se procedió a medir en una probeta 50mL de agua destilada, por consiguiente se vacío el nitrato de amonio a un vaso depresipitados con capacidad de 500mL. Por consiguiente se agregó agua a la charola para escurrir en el vaso los residuos de la sal que se adhirieron al papel, después se agregaron los 50mL de agua destilada medidos en la probeta. Posteriormente se agito el contenido del vaso con una pipeta de vidrio; ya disuelta el primer sal se agregó la segunda, el nitrato de potasio, realizando el mismo procedimiento q para la primera, ambas se disolvieron siendo agitadas con la probeta. Figura 2.

Para incorporar completamente ambas sales se colocó la solución sobre la plancha eléctrica a una temperatura de 30 °C, durante 5 minutos, agitándola cuidadosamente con la misma pipeta de vidrio ver la figura 3.

Ya incorporadas ambas sales fueron vaciadas a una probeta para aforar ahí la solución a 200 mL con agua destilada, esto se realizó cuidadosamente para obtener un volumen exacto de la solución stock de nitratos ver la figura4 en el apartado de  resultados.

VII. RESULTADOS

Los resultados obtenidos en la presente práctica fueron los esperados, ya que los cálculos realizados fueron los correctos y se logró calibrar la balanza analítica de forma correcta, en la cual se pesaron los nitratos, estos a su vez también fueron disueltos con éxito y de forma rápida en el agua destilada, gracias a que se calentó la solución en la plancha eléctrica, del tal forma que el nitrato de potasio se integró completamente con el nitrato de amonio formando una mezcla homogénea.

Saber realizar y preparar soluciones madre de forma correcta, es de gran importancia, puesto que contribuye a asegurar en cierta forma obtener buenos resultados al momento de cultivar vegetales in vitro.

Los cálculos de las sales es la primera herramienta que el alumno debe desarrollar para saber preparar soluciones stock. Los cálculos realizados en la presente práctica se citan a continuación:

Nitrato de amonio: NH4NO3	Nitrato de potasio: KNO3
NH4NO3= 1.650g/l	KNO3= 1.300g/l
1.650*100x=165g/l	1.300*100x=130g/l
165g/l*200ml/1000ml= 33g	130g/l*200ml/1000ml= 26g

Tabla 1. Cálculos realizados para las sales nitrato de sodio y nitrato de potasio.

El procedimiento fue realizado con calma y sin presiones, ya que los procesos a desarrollar requerían de paciencia y concentración para poder ser ejecutados. Los resultados y procesos abordados se ilustran y citan en la siguiente página.

Figura 1. Pesado de las sales en la balanza analítica: a) calibración de la balanza analítica; b)pesado del nitrato de amonio; c) pesado del nitrato de potasio.

Figura 2. Preparación de la solución stock: a) sales de nitratos pesadas; b) vaciado de la primer sal NH₄NO₃; c) vaciado de los residuos del primer nitrato; d) vaciado de 50Ml de agua destilada; e) agitado de la primera sal en agua destilada; f) vaciado de la segunda sal NH₄NO₃.

                               Figura 3. Calentado, agitado e incorporación de los nitratos.

Figura 4. Etiquetado y guardado de la solución: a) aforado de la solución stock a 200 mL; b) etiquetado de la solución stock en la botella ámbar; c)guardado de la solución stock sobre el refrigerador.

VIII. CONCLUSIÓNES

En la presente práctica fue posible calcular las cantidades precisas tanto de nitrato de sodio como de nitrato de potasio, así mismo ya conocida la cantidad en gramos se realizó el pesado exacto de estas y se logró preparar la solución stock de nitratos. Cabe mencionar que realizar una solución madre implica certeza y precisión, esto para asegurar buenos resultados en un futuro cuando se prepare el medio nutritivo con estas soluciones. Es de gran importancia saber realizar los cálculos e identificar los reactivos para no cometer errores de preparación. En fin es imprescindible resaltar que gracias a esta práctica el alumno adquirió nuevos y útiles conocimientos.  

IX. RECOMENDACIONES

      Para la preparación de soluciones madre es recomendable hacer bien los cálculos de los reactivos que se pesaran, esto para evitar errores.

      Es recomendable que cuando se haga la preparación de soluciones, al momento de que se estén pesando las sales no se tarde mucho tiempo debido a que estas con el aire se humedecen y esto aria más difícil el control de la balanza analítica, porque con la humedad estas pesarían más y por lo tanto no se obtendría la cantidad correcta lo cual perjudicaría en la preparación del medio de cultivo.

      Es importante que la persona que esté pesando las sales tenga mucho cuidado de que sea la cantidad correcta al pesar y no pasarse, así  como tampoco que le falte, debe ser exactamente la cantidad.

      Se recomienda que cuando se disuelvan las sales en agua destilada, esta solución se ponga sobre la plancha eléctrica a 30°C para diluirlas fácilmente.

  X. FUENTES CONSULTADAS

& Bloomfield Molly M. Química de los Organismos Vivos. México. D.F. Ed. Limusa 1997, pp. 87 – 97.

& Choppin Gregory R. Química, México Ed. Publicaciones Cultural, 1985, pp. 156, 247-349, 19-20.

& González, Cruz, Camarillo, Silos. Biotecnología Vegetal  (cultivo de tejidos, manual)  2000. SEP. 133p.

& Hill - Kolb, Química para el Nuevo Milenio. México Ed. Prentice Hall, 1998, pp. 132-133.

& joesfa@yahoo.comhttp://biotecesavf.blogspot.com/2010/01/los-medios-de-cultivo.html 25 de febrero del 2012.

&  Mary@yahoo.comhttp://blogs.mdp.utn.edu.ar/mpersico/files/2010/04/Manual-medios-cultivo.pdf. 24 de febrero del 2012.

& pablo@elkothec.Comhttp://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/ibmc/practicos/GUIA-TP-IBMC-2011.pdf. 24 de febrero del 2012

& Pellón. Acribia. La Ingeniería Genética y sus Aplicaciones. 1986. México. 237 p.

& Pierik R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1991.1 Ed. Mundiprensa España.