2.1.6 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Para la preparacion de medios culyivo es necesario obtener los componentes que este medio de culyivo tendra para obtener los explantes adasptables al medio de cultivo.lo que se hizo lo siguiente:
despues de tener la colucion madre preparadas, estas se aforan a 350 ml en un vaso de precipitado de 500 ml
posteriormente con la ayuda de un potenciomentro se midio el pH el acul debe estar en un rango de 5.0-6.5
como siguiente pado se somete a calentar en una plancha electrica a una temperatira de 50-70 grados centigrados, en este instante se le puede ir agragando poco a poco el phytagel.
posteriormente se pude dejar para que se baje un poco la temperatura, para ser vaciado a los frascos aproximadamente 25ml.
2.2 ESTERILIZACIÓN
Son una serie de métodos físico-químicos, que sirven para eliminar los m.o. y las esporas de la superficie de instrumentos y medios de cultivo.
Desinfección: Esta consiste en remover o eliminar los m.o. de un material inerte “ Bisturí”.
Desinfestación: Consiste en remover superficialmente los microorganismos con métodos suaves como:
2.2.1 TIPOS DE ESTERILIZACIÓN
FISICOS:
Agua hirviendo-baño maría
Muflas (estufas) –calor seco
Calor húmedo-autoclave “olla de presión”
Filtración
QUIMICOS:
NaCLO (hipoclorito de sodio)
CaCLO (hipoclorito de calcio)
Oxido de etileno
Ozono
H2O2 (peróxido de hidrogeno)
Nitrato de plata
Yodex
Aldehídos
Fenol
2.2.2 FACTORES QU INTERVIENEN EN EL PROCESO DE ESTERILIZACIÓN
Aspsia
Genotipo
Posicion/ccmp
Explante
Medio de cultivo
Luz
Temperatura
Polaridad humedad fase gaseosa subcultivo
Estacion
2.3 ESTABLECIMIENTO DE EL CULTIVO DE TEJIDOS
El establecimiento de tajidos vegetales, es decir la separacion de los explantes y las operaciones relacionedas con su incubacion in vitro, dependeran en gran medida del tipo de explante y el sistema de cultivo que se emple, los que a su vez dependeran del objetivo perseguido. en otras palabras, las tecnicas que se emplean para cultivar protoplastos, no son exactamente las mismas para cultivar meristemos.
2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
Etapa 0 establecimiento de plantas donadoras de explantes
Etapa 1 introduccion asepsia
Etapa 2 micropagacion
Etapa 3 enraizamiento
Etapa 4 adaptacion al clima
2.3.2 SELECCIÓN DE PLANTAS MADRES
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado.
Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia recibida
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes.
2.3.3 EXPLANTE
Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard 1999). El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.
2.3.4 SIEMBRA DE EXPLANTE
2.3.5 CONDICIONES DE INCUBACIÓN
Luz: Fotoperiodo (8-10 horas).
La longitud de onda y la intensidad lumínica deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza el cultivo de tejidos (Montoya 1991).
La alternancia de luz y oscuridad debe ser estudiada en cada caso, a pesar de que en cultivo de tejidos, puede presentarse un requisito de fotoperiodo similar a las plantas crecidas extra vitro. Se ha demostrado en algunas plantas que la longitud del día influye los niveles endógenos de auxinas y citoquininas (Montoya 1991).
Temperatura: (28ºC)
Las temperaturas pueden variar de plantas a plantas. Se afirma que los tejidos de plantas tropicales puede esperarse mejor crecimiento a temperaturas mayores que las apropiadas para el cultivo de tejidos de plantas de zonas templadas (Montoya 1991).
En general en cultivo de tejidos se utilizan temperaturas que oscilan entre 24ºC y 28ºC (Montoya 1991).Es importante además recordar la relación de la temperatura con eventos tales como la morfogénesis y las concentraciones y acción de los reguladores de crecimiento (Montoya 1991).
Humedad relativa: Los cuartos de cultivo vegetal deben permanecer controlados con aproximadamente un 70% de humedad relativa (Montoya 1991).
PRINCIPALES PROBLEMAS DE LA INCUBACION
Contaminación:
Hongos, bacterias, y si aparecen juntas (hongos y bacterias) es porque hay un mala desinfección.
Necrosis: esta muerte es debido a:
Tratamientos de desinfección agresivos
Herramientas calientes
Medio caliente
Daño del tejido con el corte
Fenolización: Es debido a la presencia de la polifenoloxidasas (enzimas), es decir a los polifenoles que son producidas por la vacuolas y se mezclan con los plastidios . Esto produceun ennegrecimiento del explante.
La oxidación se puede controlar con agentes antioxidantes tales como:
Ácido citrico, Carbón activado, L-cisteina, Polivinilpirrolidona, 4-hexilresorcinol, (HR), N-acetilcisteina (AC), ácido ascórbico (AA), ácido isoascórbico (AIA), sorbato de potasio (SP).
Los agentes antioxidantes se utilizan:
Antes y después de la disección del explante
Agregar al medio de cultivo.
Mantener el explante en ácido ascórbico hasta la siembra.
pH: En el medio de cultivo se puede controlar el pH para evitar microorganismos que pueden atacar al explante.
2.3.6 CAMBIOS FISIOLÓGICOS DEL EXPLANTE
Los cambios que sufre un explante, en un cultivo invitro son los siguientes:
· Cuticula delgada
· epidermis desorganizada
· parenquima ineficiente por lo tanto no realiza fotosintesis al 100%
· estomas no funcionales
· sufren vitrificacion
2.3.7 TRASPLANTE AL SUSTRATO
Esto se refiere al cambio de medio de cultivo al sustrato de suelo en la que las plantas clones seran sembradas, esto se da mediante aclimatizacion (endurecimiento), la rusticacion entre 4-8 semanas paultiva y secuentemente.
1. Se controla la luz desde el 20% hasta el 100%
2. Sustrato en las dos primeras semanas se riega con M.S al 25% diluido
3. La humedad relativa se mentiene desde mayor e igual a 100, normal con nebulizadores
4. Se cortan las raices de las plantas in vitro o se le agrega en raizador)
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