2.1.6 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Keywords:Culture medium Murasshine and Skoog,Phytagel, sucrose, pH, HCl, probe
Una vez realizados los cálculos, de la sacarosa y el phytagel, estos solutos fueron pesados en la balanza analítica.
Al iniciar la preparación del medio de cultivo se colocaron las soluciones madre sobre la mesa de forma ordenada para extraer la cantidad calculada (3.5ml) de cada una de ellas de forma ordenada y agregarlas a la preparación. Figura 2.
Para la preparacion de medios de cultivo es neceario contar con los componrntes necesarios para la propagacion adecuada de los explantes:
es necesario aforar los componentes a 350 ml en un vaco de precipitado
medir el pH con un poteciometro
ajustar el pH el rango esta desde los 5.0-6.5
calentar la sustancia a una temperatura de 50-70 grados centigrados e ir agregando el phytagel
vaciar la sustancia a los frascos con la cantidad aproximada de 25 ml
SEP SNEST DGEST
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
PRACTICA N.3:
PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
Que Presentan
Rosalina García Suárez 08930339
Yactivany Atanasio Serrano 08930340
Esbeide de Paz Leonides 08930371
Víctor Manuel Vargas torres 08930311
Bellanira Pineda Pineda 08930130
Lic. Biología
Ciudad Altamirano, Gro. México. Marzo del 2012
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
PRÁCTICA No.3.
PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
RESUMEN
La presente práctica se realizó, en el laboratorio de microbiología, localizado en el Instituto Tecnológico de Cd Altamirano. Se preparo un medio de cultivo que contuviera los nutrientes necesarios para permitir el crecimiento de explantes y células o incluso pequeñas plantas, por tal motivo para la reparación de este se tomaron, 10 ml de cada una de estas sustancias (nitratos, alquenos, sulfatos, orgánicos, halógenos,Fosfatos, Boratos y Molibdatos) para su posterior incorporación de phytagel y sacarosa, a un volumen 350 ml. Obteniendo un medio de cultivo con las características necesarias para el desarrollo adecuado de plantas (cultivo de Murasshine y Skoog).
Palabras clave: Medio de cultivo Murasshine y Skoog, phytagel, sacarosa, pH, HCl,probeta.
ABSTRAC
Thispracticewas held inthe microbiology laboratory, located inthe Instituto tecnologico de Ciudad Altamirano. Was prepared culture mediumcontainingthe necessary nutrientsto allow growthofcellsorexplants andsmall plants,for that reasonfor the repair ofthiswas taken, 10 ml of each ofthese substances(nitrates, alkenes, sulfates, organichalogens,phosphates, boratesand molybdates) for subsequent incorporation ofPhytageland sucroseto350 mlvolume. Getting aculture medium withthe characteristics necessaryfor the proper developmentof plants (crops andSkoogMurasshine).
Keywords:Culture medium Murasshine and Skoog,Phytagel, sucrose, pH, HCl, probe
I. ANTECEDENTES
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos, (Pedrique de Alucio, 1992).
En consecuencia, la nutrición orgánica de las plantas es un tema muy amplio que se extiende desde la nutrición de bacterias y hongos, los variados requerimientos nutricionales de partes aisladas de plantas, los requerimientos especiales de embriones aislados, los tejidos cultivados, las células y protoplastos hasta el tema tan discutido de las plantas superiores obtienen un beneficio especial de las complejas sustancias orgánicas que se encuentran principalmente en el estiércol natural y en las coberturas protectoras. Posiblemente la formación del medio para el cultivo de tejidos es más un arte que una disciplina por derecho público; la experiencia es el mejor maestro para este tipo de trabajo, y este es el mejor consejo u orientación que se le puede dar a un principiante.
Se debería trabajar con materiales que estén definidos con precisión desde el punto de vista taxonómico, genético y del desarrollo; existen muchas evidencias que sugieren que la variación en la respuesta al cultivo de tejidos según el genotipo de la forma como se haga el cultivo, (Krikorian 1990).
V. FUNDAMENTO TEÓRICO
5.1. Medio de cultivo
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los explantes vegetales.Estos medios son esenciales en el Laboratorio de tejidos de cultivo in vitro por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.
(Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992.).
En los laboratorios de cultivo de tejidos se utilizan diferentestipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificantecomo el agar, la gelatina o la sílicagel. (Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992.).
5.2.- Tipos de medios de cultivos
Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química
Definida cualiy cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación. (Ortega, Y; Quevedo F. 1991).
5.3.- Clasificación por el uso de los medios de cultivos
Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.
Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.
Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de
sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. (Ortega, Y; Quevedo F. 1991).
5.4.- Para la preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores
Que suministren productos de calidad.
Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y físico-
Química adecuada.
Utilizar materiales de vidrios bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante. (Ortega, Y; Quevedo F. 1991).
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
La presente práctica se desarrolló el día 27 de febrero del presente año en el laboratorio de microbiología,el cual se localiza dentro del instituto tecnológico de cd Altamirano.
La Cd. de Altamirano municipio de Pungarabato, se localiza al noroeste del estado de Guerrero, en la región de Tierra Caliente y en las coordenadas geográficas 18°25’ de latitud norte y los 100°31’ y 100°43’ de longitud oeste. Este municipio es muy caluroso al experimentar un clima de tipo Cálido Subhúmedo con lluvias en verano y una temperatura promedio que varía de los 26 a 28 °C. Presenta una altitud de 241 msnm y una precipitación pluvial promedio de 1000 a 1,100 mm al año.
6.1. Cálculos para realizar el medio de cultivo a base de soluciones stock
Para llevar a cabo la presente práctica, primero que nada el docente indico al grupo que se debía preparar un medio nutritivo con un volumen de 350 ml, de tal forma que cada equipo de trabajo procedió a realizar los cálculos correspondientes para cada elemento del medio a formular. Los cálculos realizados se hicieron de forma ordenada, primero se calculó el volumen de las soluciones stock preparadas en la práctica anterior (nitratos, sulfatos, quelatos, PoBoMo, Alógenos y Orgánicos) ver tabla 1. Posteriormente se realizaron los cálculos en gramos tanto para la sacarosa como para el phytagel, que en este caso fue el gelificante utilizado. Ver tabla 2.
Cabe mencionar que el medio a preparar no incluyo hormonas, aunque también para estas fueron realizados los cálculos correspondientes.
6.2. Calibrado y pesado de la sacarosa y phytagel
Antes de iniciar el pesado del azúcar y del gelificante se calibro la balanza analítica, esto para realizar un pesado preciso y exacto, así mismo se elaboraron dos pequeñas charolas de papel aluminio, sobre las cuales se colocaron los solutos a pesar.
El alumno encargado de realizar el pesado de los nitratos lo hizo cuidadosamente tratando de ser lo más exacto posible, así mismo empleo los cálculos realizados anteriormente para cada una de los elementos. El primer elemento sometido a la balanza sobre la charola de aluminio fue la sacarosa, de la cual se pesaron 10.5g. Por consiguiente fue puesta en ceros nuevamente la balanza analítica, se introdujo la segunda charola de aluminio bacía, se pesó y volvió a poner en ceros la balanza, de tal forma que se prosiguió a pesar 1.05g del gelificante phytagel. Figura 1.
6.3. Preparación del medio de cultivo
Antes de realizar la preparación del medio de cultivo MS, se sacaron las soluciones stock ya preparadas, se colocaron de forma ordenada sobre la mesa de trabajo, el orden fue el siguiente: Nitratos, Sulfatos, Quelatos, PoBoMo, Alógenos y Orgánicos. El orden de estas fue para evitar la confusión al momento de hacer la adición de estas al vaso depresipitados.
Una vez colocadas las botellas contenedoras de las soluciones stock sobre la mesa de trabajo, se colocó una pipeta de vidrio exclusiva de cada de ellas, posteriormente cada equipo tomo un vaso depresipitados con una capacidad de 500ml, al cual le fueron agregados 100ml de agua destilada, previamente medida en una probeta de plástico. Así mismo se prosiguió a agregar 3.5ml de cada una de las soluciones madre al vaso, haciendo uso de la pipeta individual de cada solución. Ver figura 2.
Una vez adheridas las soluciones stock a la preparación en el vaso depresipitados, se prosiguió a agregar la sacarosa (azúcar morena) y a disolverla, para ello se agito cuidadosamente con una pipeta de vidrio hasta disolverla perfectamente. Figura 3. Una vez disuelta la sacarosa en el medio, este se vació a una probeta de plástico de 1l. Ya contenida la solución en la probeta, el preparado se aforo cuidadosamente a 350ml con agua destilada. Figura 4.
La preparación del medio se vació nuevamente al vaso depresipitados, esto para someterla al peachimetro. Antes de realizar la determinación y regulación de pH de la solución, el peachimetro fue calibrado por el facilitador, el cual hizo uso de soluciones buffer con un pH de 4.0 y otra de 7.0. Ver figura 5. Una vez calibrado el aparato se prosiguió a medir el pH de la preparación, para ello se presionó el botón de standbay y fueron sumergidos los electrodos a la solución, por consiguiente se desactivo el botón standbay y se determinó el pH de esta, el cual fue muy bajo y para elevarlo entre un rango de 5.7 - 6.0 le fue agregado HCl. Ver figura 6. Ya determinado y establecido el pH dentro del rango establecido se retiraron los electrodos del medio y se volvió a activar el botón standbay para que otro equipo prosiguiera con a realizar el mismo proceso.
La solución ya preparada y con un pH adecuado se colocó sobre la plancha eléctrica a una temperatura de 100 C, ahí se dejo hasta alcanzar una temperatura entre el rango de 50 – 70 C, la cual fue medida con un termómetro de mercurio, ya alcanzado el rango establecido,la temperatura de la plancha se bajó a 40 C, posteriormente se agregó el phytagel de forma lenta y cuidadosa, mientras se incorporaba a la solución, al ser agitado con una pipeta de vidrio constantemente, al terminar el vaciado del phytagel se volvió a subir la temperatura a 60 C y se dejó ebullir el medio, contando a partir de su ebullición 2 min, para posteriormente retirarlo de la plancha y dejarlo secar sobre un cuaderno en la mesa de trabajo. Figura 7.
6.4. Vaciado y guardado del medio de cultivo
Antes de realizar el vaciado del medio de cultivo fueron etiquetados 15 frascos de vidrio con tapa, utilizando un 16 como referencia, al cual se le agrego 20ml de agua y se selló, esto para hacer un vaciado uniforme del medio en los 15 frascos etiquetados.
El vaciado del medio de cultivo se realizó cuidadosamente, utilizando una franela para evitar quemaduras, por consiguiente fue vaciado el medio en cada uno de los frascos y al finalizar fueron cerrados cada uno con su respectiva tapa. Figura 8.
Una vez llenados y cerrados herméticamente los frascos fueron sellados con plástico para evitar su contaminación, por consiguiente se colocaron en una charola y fueron almacenados enla hielera del refrigerador.
. RESULTADOS
Los resultados obtenidos en la presente práctica fueron los esperados, ya que fue posible conocer y realizar el procedimiento de la preparación del medio de cultivo MS de forma exitosa.
Para determinar la cantidad de cada una de las soluciones stock que debían integrar el medio nutritivo a formular, se hicieron los cálculos necesarios. Estos cálculos consistieron en formular 350 ml de medio el cual se formuló a una concentración de 1x, para ello se multiplicaron las cantidades anteriores y fueron divididas entre la concentración (100x) de cada una de las 6 soluciones madre ya preparadas. Tabla 1.
Tabla 1. Cálculos realizados para vaciar las soluciones stock al medio fueron las siguientes:
SOLUCIÓN STOCK
|
CÁLCULOS
|
Nitratos
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
Sulfatos
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
Quelatos
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
PoBoMo
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
Alógenos
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
Orgánicos
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
Fue necesario realizar cálculos para adherir al medio azúcar y gelificante, para ello se hizo una regla de tres, donde se multiplico el volumen del medio a preparar (350ml), por 30g de sacarosa que corresponden a la solución en un litro de medio, por ello se buscó obtener la cantidad en gramos de azúcar, de tal forma que el resultado de la multiplicación fue dividido entre 1000ml, obteniendo así la cantidad de azúcar a pesar. Tabla 2. Para calcular la cantidad de phytagel que se debía adherir a la preparación, se siguió el mismo proceso pero multiplicando el volumen del medio por 3g, los cuales corresponden a la solución de gelificante en un litro de medio, lo obtenido de la multiplicación fue dividido entre 1000ml, dando como resultado la cantidad de phytagel que fue agregada al medio. Tabla 2.
Tabla 2. Cálculos realizados para el pesado se sacarosa y phytagel.
SACAROSA
|
PHYTAGEL
|
350ml*30g/1000ml=10.5g
|
350ml*3g/1000ml=1.05g
|
Figura 1. Calibración y pesado se solutos: a) calibrado de la balanza analítica; b) pesado de
10.5g de sacarosa; c) pesado de 1.05g de gelificante phytagel.
Al iniciar la preparación del medio de cultivo se colocaron las soluciones madre sobre la mesa de forma ordenada para extraer la cantidad calculada (3.5ml) de cada una de ellas de forma ordenada y agregarlas a la preparación. Figura 2.
Figura 2. Vaciado de las soluciones stock a la preparación: a) soluciones stock con su respectiva pipeta; b) extracción de la solución stock; c) vaciado de la solución stock a la preparación.
El azúcar se vacío a la preparación y se disolvió agitándose con una pipeta de vidrio. Figura 3.
Figura 3. Disolución de la sacarosa a la preparación del medio de cultivo.
Una vez disuelta la sacarosa en la preparación, esta se vació a una probeta de plástico donde fue aforada cuidadosa y exactamente a 350ml. Figura 4.
Figura 4. Aforado de la preparación del medio de cultivo a 350ml.
Para medir el pH del medio nutritivo a preparar se hizo uso del peachimetro, el cual fue calibrado con soluciones buffer de 4 y 7 de pH. Una vez calibrado, se midió el pH del preparado dando como resultado un pH de 4.42, el cual fue estabilizado dentro del rango establecido (5.7-6.0), para ello le fue agregado HCl subiendo el pH a 5.81. Figura 5.
Figura 5. Calibración del peachimetro y medición de pH: a) calibración del peachimetro con buffer de 7; b) peachimetro calibrado; c) medición del pH del preparado; d) adición de HCl para elevar el pH; e); agitado de la preparación con HCl; f) preparación con pH dentro del rango establecido.
Para realizar la adición del phytagel a la preparación del medio de cultivo, primero que nada se colocó la solución sobre la plancha eléctrica, a la cual se le vació el gelificante poco a poco cuando presento una temperatura de 70 ºC. El gelificante fue disuelto con una varilla de vidrio e incorporado a la solución, posteriormente se dejó ebullir durante dos minutos y se dejó enfriar sobre la mesa de trabajo. Figura 6.
Figura 6. Adición del gelificante al medio de cultivo: a) medición de la temperatura; b) vaciado del phytagel al medio; c) agitado del medio de cultivo para incorporar el gelificante; d) ebullición del medio de cultivo.
El medio de cultivo caliente fue vaciado cuidadosamente a 15 frascos de vidrio previamente etiquetados, para ello se usó una medida de referencia en otro frasco (20ml), esto para hacer un vaciado relativamente uniforme, una vez vaciado el medio, los vasos se cerraron y sellaron para almacenarlos en la hielera del refrigerador. Figura 7.
Figura 7. Vaciado y almacenado del medio de cultivo: a) vaciado del medio de cultivo; b) cerrado de los frascos herméticamente; c) sellado de los frascos; d) almacenado de los medios de cultivo.
VIII.CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
8.1. CONCLUSIONES
Con la realización de la práctica de preparación de medios para el cultivo de tejidos vegetales, se lograron los objetivos establecidos en la misma, proporcionando al alumno gran conocimiento de cómo prepararlo y cuáles son los nutrimentos necesarios de acuerdo a la consistencia que el medio de cultivo obtuvo. Es importante mencionar que se obtuvieron buenos resultados ya que se pudo hacer la preparación del medio sin dificultad alguna.
Una vez realizado el medio de cultivo para vegetales será posible propagar explantes en ellos obteniendo vegetales in vitro.
8.2. RECOMENDACIONES
Es necesario que cuando se prepare el medio de cultivo para tejidos vegetales se tomen las medidas necesarias para que el preparado tenga las condiciones físicas y químicas necesarias para una buena propagación de cultivos in vitro en un futuro.
Se recomienda que el phytagel se le agregue a la solución cuando esta se encuentra caliente para que se pueda disolver perfectamente y que este mismo se agregue pausadamente y en pequeñas cantidades.
Es recomendable que cuando se realicen prácticas o investigaciones se hagan con el cuidadonecesario ya que cuando se le agrega el gelificante se tiene que diluir completamente para evitar que queden grumos en la solución y así obtener una buena preparación de medio para el cultivo de tejidos vegetales.
IX.-FUENTES CONSULTADAS
Gonzales, cruz, caramillo, silos. 2000. Biotecnología Vegetal. (Cultivo de tejidos, manual) SEP, México, 133p.
Pierik R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1 Ed. Mundiprensa España.
Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.
Merck. 2002. Microbiology Manual
Alimentaria. Organización Panamericana de la Salud. Harla S.A. México D.F.
Prof. Sofía Gutiérrez de Gamboa.
Krikorian A.D. 1990. Capítulo 3 Medios de cultivo: generalidades, composición y preparación. Departament of Biochemestry, State University Stony Brook. New York, E.U. 37 p.
Ortega, Y; Quevedo F. 1991. Garantía de la Calidad de los Laboratorios de Microbiología
Pedrique de Alucio, M. 1992. Microbiología: Manual de medio generales segunda edición. Facultad de Farmacia. Universida
2.2 ESTERILIZACIÓN
Son una serie de métodos físico-químicos, que sirven para eliminar los m.o. y las esporas de la superficie de instrumentos y medios de cultivo.
Desinfección: Esta consiste en remover o eliminar los m.o. de un material inerte “ Bisturí”.
Desinfestación: Consiste en remover superficialmente los microorganismos con métodos suaves como:
- HgCl2
- NaClO
- ALCOHOL
2.2.1 TIPOS DE ESTERILIZACIÓN
FISICOS:
Mechero-fuego directo
Agua hirviendo-baño maría
Bacto-incinerador
Luz UV
Muflas (estufas) –calor seco
Calor húmedo-autoclave “olla de presión”
Filtración
QUIMICOS:
NaCLO (hipoclorito de sodio)
CaCLO (hipoclorito de calcio)
Oxido de etileno
Ozono
H2O2 (peróxido de hidrogeno)
Nitrato de plata
Yodex
Aldehídos
Fenol
2.2.2 FACTORES QU INTERVIENEN EN EL PROCESO DE ESTERILIZACIÓN
Aspsia
Genotipo
Posicion/ccmp
Explante
Medio de cultivo
Luz
Temperatura
Polaridad humedad fase gaseosa subcultivo
Estacion
2.3 ESTABLECIMIENTO DE EL CULTIVO DE TEJIDOS
El establecimiento de tajidos vegetales, es decir la separacion de los explantes y las operaciones relacionedas con su incubacion in vitro, dependeran en gran medida del tipo de explante y el sistema de cultivo que se emple, los que a su vez dependeran del objetivo perseguido. en otras palabras, las tecnicas que se emplean para cultivar protoplastos, no son exactamente las mismas para cultivar meristemos.
Keywords: Explants, sterilization, disinfest,MS medium,laminar flow cabinet, Camote de palo (Manihot esculenta
)
PRACTICA N.4: SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)
SEP SNEST DGEST
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
PRACTICA N.4:
SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)
Que Presentan
Rosalina García Suárez 08930339
Yactivany Atanasio Serrano 08930340
Esbeide de Paz Leonides 08930371
Víctor Manuel Vargas Torres 08930311
Bellanira Pineda Pineda 08930130
Lic. Biología
Ciudad Altamirano, Gro. México. Marzo del 2012
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
PRÁCTICA No.4. SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)
RESUMEN
La presente práctica se realizó, en el laboratorio de microbiología, localizado en el Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano. Para la iniciar la siembra del material vegetal fue necesario desinfectar la cámara de flujo laminar con suficiente alcohol, así mismo los explantes utilizados de Camote de palo (Manihotesculenta) fueron desinfestados con cloralex al 5% durante cinco minutos y dos enjuagues con agua destilada, el primero durante 1 minuto y el segundo durante 5. La siembra de los explantes se realizó en la cámara de flujo sobre el medio de cultivo MS. Los resultados obtenidos no fueron los esperados ya que más del 50% de los cultivos se contaminaron con hongos y bacterias. Esta práctica se realizó con la finalidad de sembrar yemas axilares para la obtención de plántulas inocuas. Concluyendo que los explantes se infestaron a causa del mal funcionamiento de la cámara de flujo laminar, aunado también a un error cometido por el docente, ya que este apagola cámara, la cualdejo de funcionar durante 15 minutos.
Palabras clave:Explantes, esterilización, desinfestar, medio MS, cámara de flujo laminar, Camote de palo (Manihot esculenta).
ABSTRAC
This practice was held in the microbiology laboratory, localizado en el Instituto Tecnologico deCd.Altamirano.Tostart theplantingof plant materialwasnecessary to disinfectthelaminarflow chamberwith enough alcohol, likewise the explantsusedwoodenSweet Potato(Manihot esculenta) were disinfestedwith5%Cloralexfor fiveminutes and tworinseswith distilled water,thefirstfor 1minute and thesecond for 5. Planting ofthe explantswas performed inthe flow chamberonMS medium. The resultsobtained were notexpectedsince morethan 50% of the cultures were contaminatedwith fungiand bacteria.This practicewas performed withthe purpose ofaxillary budsgrowfor obtainingplantletsharmless.Concluding thatthe explantswere infesteddue tomalfunction of thelaminar flow hood, alsocoupledto a mistake madeby the teacher, for this I turn off thecamera, whichstopped workingfor 15minutes.
Keywords: Explants, sterilization, disinfest,MS medium,laminar flow cabinet, Camote de palo (Manihot esculenta
I. ANTECEDENTES
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micro propagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fotoquímicos, estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal. El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos crecerán y se desarrollaran a partir del explante original depende de los objetivos del cultivo de tejidos, (Hicks G.S., 1980).
El cultivo de tejidos in vitro comprende, en su acepción amplia, un heterogéneo grupo de técnicas mediante las cuales un explante (parte separada de un vegetal, por ejemplo: protoplastos, célula, tejido, órgano) se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Las posibilidades de aplicación de tales cultivos se pueden resumir así: a) estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines, b) bioconversion y producción de compuestos útiles, c) incremento de la variabilidad genética, d) obtención de plantas libres de patógenos, e) propagación de plantas y f) conservación e intercambio de germoplasma, ( Roca w. M., Mroginski l. A., 1991).
Las técnicas que se emplean para cultivar protoplastos no son exactamente las mismas que se usan para cultivar meristemos; del mismo modo, un determinado sistema de cultivo puede ser de gran utilidad para el logro de un objetivo pero puede ser no útil para otro, (Bonner, J., 1936).
II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
En la presente práctica se pretende sembrar yemas axilares de Manihot esculenta en el medio de cultivo MS. Para ello la siembra debe llevarse a cabo en las mejores condiciones de asepsia y con materiales esterilizados, así mismo los explantes a sembrar deben encontrarse perfectamente desinfestados, esto para evitar la contaminación del medio de cultivo o infestación del explante por hongos y bacterias.
La amplitud de la definición de cultivo de tejidos y los numerosos objetivos que estos persiguen constituyen serios escollos en cualquier intento de generalización sobre los factores que afectan el establecimiento de tales cultivos in vitro, y obligan a consideraciones previas para delimitar los alcances de los mismos. Como lo son estrictas medidas de asepsia, tipo de planta y preparación aséptica de los explantes a utilizar.
III. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Realizar siembra de explantes vegetales de (Manihot esculenta)en medios de cultivo- in vitro para la propagación de plántulas.
3.2. Objetivos específicos
Preparar y desinfectar la cámara de flujo laminar
Introducción y preparado del material y reactivos a utilizar dentro de la cámara de flujo laminar
Desinfestado y preparado de los explantes
Siembra de los explantes al medio de cultivos
Sellado y guardado de los cultivos in vitro
IV. JUSTIFICACIÓN
El cultivo in vitro es una técnica que permite la propagación de vegetales a partir de una pequeña porción de planta madre y por resultado se pueden obtener un gran número de plantas idénticas a la madre, libres de microorganismos y en un corto periodo de tiempo. Así mismo realizar cultivo de tejidos in vitro de plantas permitirá al alumno reconocer el manejo apropiado del material vegetal bajo condiciones estrictas de asepsia y esterilización.Ya que el cultivo in vitro, necesita condiciones óptimas para su desarrollo y crecimiento, en lo que se refiere a factores físicos y nutricionales para que no se formen colonias de bacterias y hongos. El cultivo in vitro es favorable para la multiplicación masiva de plantas a partir de un pequeño explante, lo cual favorece directamente a la economía de quien lleve a cabo este proceso.
V. FUNDAMENTO TEÓRICO
5.1 CULTIVO IN VITRO
El cultivo in vitro se define como el cultivo en un medio nutritivo, en condiciones estériles, de plantas, semillas, órganos, explantes, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores. (Hanning, 1904)
Estas técnicas se caracterizan porque:
Ø Ocurren a micro-escala, sobre todo en una superficie pequeña;
Ø Se optimizan las condiciones ambientales, en lo que se refiere a factores físicos, nutricionales y hormonales;
Ø Se excluyen todos los microorganismos (hongos, bacterias y virus), así como también las plagas de las plantas superiores (insectos y nematodos)
Generalmente no se reproduce el patrón normal de desarrollo de una planta, resultando que un tejido aislado puede dar origen a un callo o puede desarrollarse de otras formas poco usuales (por ejemplo, formación de órganos, embriogénesis somática). La capacidad de cultivar protoplastos o células individuales permite manipulaciones que antes era imposibles. El nombre de cultivo in vitro (que generalmente quiere decir en vidrio), se utilizó porque, al menos inicialmente, se usaron recipientes de vidrio para el cultivo(Hanning, 1904)
5.2 Micro propagación
La micro propagación es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades.Lamicro propagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas porla ingeniería genética, mutagénesiso mejoramiento genético.
Se utiliza también la micropropagación para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.
5.3Tipos de explantes
Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard, 1999).
El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son más bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero sí lo es para el fito- mejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo (Fossard, 1999).
5.4 Asepsia de explantes
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte&Kleyn, 1996)
Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado.
5.5 Tapado y sellado de los explantes
Una vez que el explante está en el medio, se sella el frasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.
Una vez que los explantes, luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento, han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte.Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece en condiciones normales y al cabo de una semana está lista para ser trasladada al campo de cultivo (Fossard, 1999).
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
La presente práctica fue realizada el día 13 de marzo del presente año, esta se desarrolló en el laboratorio de microbiología que se localiza dentro del instituto tecnológico de cd Altamirano.
La Cd. Altamirano municipio de Pungarabato, se localiza al noroeste del estado de Guerrero, en la región de Tierra Caliente y en las coordenadas geográficas 18°25’ de latitud norte y los 100°31’ y 100°43’ de longitud oeste. Este municipio es muy caluroso al experimentar un clima de tipo Cálido Subhúmedo con lluvias en verano y una temperatura promedio que varía de los 26 a 28 °C. Presenta una altitud de 241 msnm y una precipitación pluvial promedio de 1000 a 1,100 mm al año.
6.1. Preparación y desinfección de la cámara de flujo laminar
Para llevar a cabo la presente práctica, antes que nada fueron repartidas las laboreas a realizar, asignando por el mismo equipo, determinadas actividades a cada uno de sus integrantes, de tal forma que cada alumno se encargó de ejecutar los procesos que le correspondían.
Seinició a limpiar la superficie de trabajo en la campana de flujo laminar, para ello se hizo uso dealcohol y papel higiénico; este segundo se humedeció con abundante alcohol y sefroto sobre el área de trabajo, repitiendo una y otra vez el mismo procedimiento hasta cerciorarse de que la superficie ya se encontraba limpia. Una vez seca el área de siembra, se procedióa encender la cámara de flujo laminar para iniciar la introducción de cada uno de los artículos, materiales y reactivos a utilizar dentro de la zona de trabajo.
6.2.Introducción y preparación del material y reactivos a utilizar dentro de la cámara de flujo laminar
El alumno responsable de trabajar en la campana de flujo laminar antes de operar en ella se esterilizo las manos con suficiente alcohol al 70%, posteriormente se introdujo en ella una lámpara de alcohol encendida y preparada anteriormente, así mismo el alumno destinado a trasportar el material estéril de afuera a una orilla de la cámara de flujo, se esterilizo las manos, mientras que el operador se encargó de organizar el material dentro del área de siembra, para ello introdujo los frascos contenedores del medio de cultivo preparados en la práctica anterior, posteriormente se introdujeron frascos estériles con agua destilada. Posteriormente se prosiguió a destapar un frasco esterilizado con agua destilada y le fue retirada la tercera parte de esta, completando esta después con cloralex al 5%, mientras que en otro frasco vacío fueron colocadas las pinzas de metal junto con el bisturí, al cual anteriormente le fue colocada la navaja estéril. Ver figura 1.Ya listas las sustancias y material necesario para operar dentro del área de trabajo en la cámara de flujo la minar se prosiguió con la desinfección de los explantes.
6.3. Des infestación y preparación de los explantes
Posteriormente se introdujeron lasporciones de planta de guacamote o camote de palo (Manihotesculenta) a la cámara de flujo laminar y se vaciaron al frasco con la solución de cloralex al 5%, ahí se agitaron y se dejaron dúrate 5 minutos, una vez transcurrido el tiempo establecido se retiró la solución del frasco vaciándola cuidadosamente en un vaso depresipitados con capacidad de 500ml., evitando dejar salir los explantes de este. Ver figura 2. Por consiguiente los explantes fueron lavados durante 1 minuto con agua destilada, agregando esta al mismo frasco y agitándolotambién, así mismo después del minuto estimado el agua fue retirada de este de la misma forma que en el paso anterior, esto para agregar después por segunda vez agua estéril y realizar otro lavado de explantes, pero este segundo con una duración de 5 minutos, de igual forma se retiró el agua dejando solo los explantes sobre el frasco.
Una vez desinfectados los fragmentos de planta, estos se sacaron de uno por uno con las puntas de las pinzas previamente esterilizadas en alcohol y flameadas sobre la llama de la lámpara de alcohol, estas se fueron colocadas sobre una caja petri esterilizada. Por segunda ocasión se hizo uso de las pinzas metálicas, las cuales fueron esterilizadas nuevamente, para ello se sumergieron primero a al frasco con alcohol y se flamearon sobre el fuego de la lámpara de alcohol, ver figura 3., este mismo procedimiento se realizó para esterilizar el bisturí, por consiguiente se esperó a que ambos utensilios se enfriaran y se prosiguió a cortar el tejido decolorado de los extremos de cada porción de planta, así mismo fueron cortadas cuidadosamente cada uno de ellas para extraer varios explantes y evitar dañar la yema axilar, que en este caso fue el explante que se pretendió propagar. Ver figura 4. Este procedimiento fue realizado para cada una de las porciones de planta hasta completar los 15 explantes requeridos.
6.4. Siembra de los explantes al medio de cultivos
Una vez realizada la desinfección de los explantes de guacamote o camote de palo (Manihotesculenta),se prosiguió a sembrar cada uno sobre los medios de cultivo preparados en la práctica anterior, para ello se hizo uso de las pinzas, con las cuales fue tomado el explante, para ello, estas fueron esterilizadas con alcohol y sometidas a la flama de la lámpara de alcohol, prosiguiendo de tal forma a tomar con ellas el explante y abrir un frasco de cultivo para introducir este sobre el medio, así mismo una vez sembrado el explante sobre el sustrato, se volvió a cerrar el frasco. Ver figura 5. Este mismo procedimiento se realizó para sembrar los quince explantes sobre su respectivomedio nutritivo, cabe mencionar que en este equipo el maestro indicó sembrar tres explantes por integrante.Así que cada uno se responsabilizó de estos, tomando las medidas adecuadas y condiciones de esterilidad necesarias para obtener buenos resultados. Los frascos fueron identificados con la inicial del alumno que lo sembró con la finalidad de diferenciar los cultivos.
6.5. Sellado y guardado de los cultivos in vitro
Una vez sembrados los quince explantes en su respectivo medio, los frascos fueron sellados uno, por uno, dando tres vueltas con parafilm sobre el borde entre la tapa y el frasco,esto para evitar la entrada de esporas o microorganismos que pudieran contaminar el medio. Una vez sellados los frascos estos fueron tomados cuidadosamente por su parte media y colocados sobre una charola de plástico previamente esterilizada, para transportarlos al lugar donde fueron incubados.
VII. RESULTADOS
Los resultados obtenidos en la presente práctica no fueron tan satisfactorios ya que se presentó un alto índice de contaminación por hongos y bacterias en los cultivos. Los cuales se atribuyen principalmente a la falla que presenta la cámara de flujo laminar del laboratorio de microbiología, aunado también a que facilitador cometió el error de apagar la misma, y el equipo se dio cuenta de este hecho 15 minutos después, durante los cuales se realizó la disección de los explantes y siembra de estos en los primeros 4 medios de cultivo.
Cabe mencionar que los resultados citados a continuación fueron registrados el día 21 de marzo de este año obteniendo 7 cultivos contaminados de 15, de los cuales 4 estaban infestados por hongos y 3 por bacterias, aumentando la cantidad de medios de cultivo infestados por hongos a ocho para el día 22 de marzo. Figura 6. Los registros y cálculos porcentuales se encuentran registrados en las tablas 1 y 2, y representados de forma estadística en las gráficas 1y 2.
Tabla 1. Cálculos de los medios de cultivo contaminados y no contaminados.
DATOS
|
CALCULOS
|
Total de medios de cultivo sembrados: 15
|
15 Cultivos= 100%
|
Cultivos contaminados: 8
|   15 Cultivos 100%
8 Cultivos 53%
|
Cultivos no contaminados: 7
|
15 Cultivos 100%
7 Cultivos 47%
|
Grafica 1. Porcentaje de cultivos contaminados y no contaminados.
Tabla 2. Cálculos de los medios de cultivo contaminados tanto por hongos como por bacterias.
DATOS
|
CÁLCULOS
|
Total de medios de cultivo contaminados: 8
|
8Cultivos= 100%
|
Cultivos contaminados por hongos: 5
|   8 Cultivos 100%
5 Cultivos 62.5%
|
Cultivos contaminados por bacterias: 3
|
8 Cultivos 100%
3 Cultivos 37.5%
|
Grafica 2. Porcentaje de medios de cultivo contaminados por hongos y por bacterias.
Figura 1. Introduccion y preparación de reactivos dentro de la cámara de flujo laminar:
a) Introducción de los medios de cultivo a la campana de flujo laminar; b) preparación de la solución cloralex al 5%.
Figura 2. Desinfección de las porciones de Manihot esculenta: a) desinfección de las porciones de planta en cloralex al 5%; b) vaciado de la solución desinfectante al vaso depresipitados.
Figura 3. Esterilización del material metálico: a) esterilización de las pinzas de disección por calor seco; b) flameado del bisturí sobre la llama de la lámpara de alcohol.
Figura 4. Disección del tejido decolorado de la porción de planta Manihot esculenta para la extracción de explantes.
Figura 5. Siembra de explantes (yemas laterales de Manihot esculenta): a) toma del explante con las pinzas de disección; b) siembra del explante sobre el medio nutritivo MS.
Figura 6. Medios de cultivo in vitro de Manihotesculenta contaminados tanto por hongos como por bacterias.
VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
8.1.Conclusiones
De acuerdo a los objetivos establecidos en la practica se pudo conocer el manejo apropiado que se les dio a los explantes que se sembraron en el medio de cultivo in vitro y cuales deben de ser las medidas de asepsia que se tiene que llevar a cabo dentro de la cámara de flujo laminar; en este caso se puede decir que la practica no fue tan satisfactoria debido a que la cámara estuvo fallando es por ello que hubo un gran porcentaje de contaminación por lo cual esto hiso que el manipuleo de los explantes a sembrar se hiciera mucho más difícil teniendo como consecuencia un 53% de contaminación de los explantes sembrados en el medio de cultivo; ya que estos fueron colonizados tanto de hongos como de bacterias siendo así esta practica fue como un ensayo para aprender como se debe de hacer el proceso de la siembra de cultivos in vitro .
8.2.Recomendaciones
ü Se recomienda que la cámara de flujo laminar funcione perfectamente ya que de esto dependerá la seguridad de que no se contaminen la siembra de los cultivos.
ü Se recomienda que la cámara de flujo laminar se limpie completamente para evitar que haya esporas de hongos o algún tipo de microorganismos que puedan afectar, antes de proceder con la siembra de los explantes,
ü Es preferible que cuando se estén manipulando los explantes se haga de la mejor manera; es decir que el operador que este trabajando con ello se desinfeste bien las manos con alcohol al 70% para matar cualquier microorganismo.
ü También es recomendable que se esterilicen bien las pinzas, el bisturí para evitar la contaminación de los explantes durante la disección esto se debe de realizar con las medidas necesarias de saneamiento ya que de esto dependerá el obtener buenos resultados.
ü Se recomienda que el operador que este frente a la cámara de flujo laminar tome en cuenta las medida sanitarias que debe de tener para evitar que los explantes se contaminen para ello la persona que esta haciendo todo el proceso no debe de meter la cabeza a la cámara de flujo laminar también debe de evitar el estar hablando, y algo muy importante siempre que se este realizando la siembra esto se debe de hacer en medio de la cámara así para evitar que los medios de cultivos in vitro se contaminen tanto de hongos como bacterias.
IX. FUENTES CONSULTADAS
Favian.Rojas.@hotmil.com.mx (Kyte & Kleyn 1996 http://cultivo de vegetales. blogspot. Mx /2010/09/ explantes. html).
Asucenaortiz.bio@hotmail.com.mx1999,http://cultivodevegetales.blogspot.mxfe. Consultado 2010/09/ explantes. html).
Bonner, J. 1936. Plant tissue cultures from a hormone point of view. Proc. Nat. Acad. Sci. 22: 426-430.
Carmen.360@gmail.com.mx (Fossard 1999, http://cultivodevegetales.blogspot.mx/2010/09/explantes.html).
Franciscojv@gmail.com.mx
González, Cruz, Camarillo, Silos. 2000, Biotecnología Vegetal (cultivo de tejidos, manual); SEP. 133p.
Hicks G.S. 1980. Patterns of organ development in plant tissue culture and the problem of organ determination. Bot. Rev. 46: 1-23.
Javier.90@hotmail.com.mx(Fossard.1999,http://cultivodevegetales.blogspot.mx/2010/09/explantes.html).
Jose.02@hotmail.com.mx(dictionary.reference.com. 2008.http://es.wikipedia.org/wiki/Micropropagacion; Consultado el 17-03-
Mariavasquez.08@hotmail.com.mx http://cultivodevegetales. blogspot. Mx /2010/09/ explantes. html).
Pedro.rsy@hotmail.com.mx http://cultivo de vegetales. blogspot. Mx consultado /2010/09/ explantes. html).
Pellón. 1986. La Ingeniería Genética y sus Aplicaciones. Acribia. México. 237
Ricardo.frag@hotmail.com.mx 1998 http://www.jardinbotanicodecordoba.com/inves_cons_cult_invi.php
ROCA W. M., MROGINSKI L. A. 1991, Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones. Ed. Centro Internacional de Agricultura Tropical, Colombia
2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
Etapa 0 establecimiento de plantas donadoras de explantes
Etapa 1 introduccion asepsia
Etapa 2 micropagacion
Etapa 3 enraizamiento
Etapa 4 adaptacion al clima
2.3.2 SELECCIÓN DE PLANTAS MADRES
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado.
Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia recibida
Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia recibida
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes.
2.3.3 EXPLANTE
Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard 1999). El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.
2.3.4 SIEMBRA DE EXPLANTE
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996).
Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.
Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.
2.3.5 CONDICIONES DE INCUBACIÓN
Luz: Fotoperiodo (8-10 horas).
La longitud de onda y la intensidad lumínica deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza el cultivo de tejidos (Montoya 1991).
La alternancia de luz y oscuridad debe ser estudiada en cada caso, a pesar de que en cultivo de tejidos, puede presentarse un requisito de fotoperiodo similar a las plantas crecidas extra vitro. Se ha demostrado en algunas plantas que la longitud del día influye los niveles endógenos de auxinas y citoquininas (Montoya 1991).
Temperatura: (28ºC)
Las temperaturas pueden variar de plantas a plantas. Se afirma que los tejidos de plantas tropicales puede esperarse mejor crecimiento a temperaturas mayores que las apropiadas para el cultivo de tejidos de plantas de zonas templadas (Montoya 1991).
En general en cultivo de tejidos se utilizan temperaturas que oscilan entre 24ºC y 28ºC (Montoya 1991).Es importante además recordar la relación de la temperatura con eventos tales como la morfogénesis y las concentraciones y acción de los reguladores de crecimiento (Montoya 1991).
Humedad relativa: Los cuartos de cultivo vegetal deben permanecer controlados con aproximadamente un 70% de humedad relativa (Montoya 1991).
PRINCIPALES PROBLEMAS DE LA INCUBACIONLa longitud de onda y la intensidad lumínica deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza el cultivo de tejidos (Montoya 1991).
La alternancia de luz y oscuridad debe ser estudiada en cada caso, a pesar de que en cultivo de tejidos, puede presentarse un requisito de fotoperiodo similar a las plantas crecidas extra vitro. Se ha demostrado en algunas plantas que la longitud del día influye los niveles endógenos de auxinas y citoquininas (Montoya 1991).
Temperatura: (28ºC)
Las temperaturas pueden variar de plantas a plantas. Se afirma que los tejidos de plantas tropicales puede esperarse mejor crecimiento a temperaturas mayores que las apropiadas para el cultivo de tejidos de plantas de zonas templadas (Montoya 1991).
En general en cultivo de tejidos se utilizan temperaturas que oscilan entre 24ºC y 28ºC (Montoya 1991).Es importante además recordar la relación de la temperatura con eventos tales como la morfogénesis y las concentraciones y acción de los reguladores de crecimiento (Montoya 1991).
Humedad relativa: Los cuartos de cultivo vegetal deben permanecer controlados con aproximadamente un 70% de humedad relativa (Montoya 1991).
Contaminación:
Hongos, bacterias, y si aparecen juntas (hongos y bacterias) es porque hay un mala desinfección.
Necrosis: esta muerte es debido a:
Tratamientos de desinfección agresivos
Herramientas calientes
Medio caliente
Daño del tejido con el corte
Fenolización: Es debido a la presencia de la polifenoloxidasas (enzimas), es decir a los polifenoles que son producidas por la vacuolas y se mezclan con los plastidios . Esto produceun ennegrecimiento del explante.
La oxidación se puede controlar con agentes antioxidantes tales como:
Ácido citrico, Carbón activado, L-cisteina, Polivinilpirrolidona, 4-hexilresorcinol, (HR), N-acetilcisteina (AC), ácido ascórbico (AA), ácido isoascórbico (AIA), sorbato de potasio (SP).
Los agentes antioxidantes se utilizan:
Antes y después de la disección del explante
Agregar al medio de cultivo.
Mantener el explante en ácido ascórbico hasta la siembra.
pH: En el medio de cultivo se puede controlar el pH para evitar microorganismos que pueden atacar al explante.
Mantener el explante en ácido ascórbico hasta la siembra.
pH: En el medio de cultivo se puede controlar el pH para evitar microorganismos que pueden atacar al explante.
2.3.6 CAMBIOS FISIOLÓGICOS DEL EXPLANTE
Los cambios que sufre un explante, en un cultivo invitro son los siguientes:
· Cuticula delgada
· epidermis desorganizada
· parenquima ineficiente por lo tanto no realiza fotosintesis al 100%
· estomas no funcionales
· sufren vitrificacion
2.3.7 TRASPLANTE AL SUSTRATO
Esto se refiere al cambio de medio de cultivo al sustrato de suelo en la que las plantas clones seran sembradas, esto se da mediante aclimatizacion (endurecimiento), la rusticacion entre 4-8 semanas paultiva y secuentemente.
1. Se controla la luz desde el 20% hasta el 100%
2. Sustrato en las dos primeras semanas se riega con M.S al 25% diluido
3. La humedad relativa se mentiene desde mayor e igual a 100, normal con nebulizadores
4. Se cortan las raices de las plantas in vitro o se le agrega en raizador)
.
